Svoj talent za glumu otkrio je u djetinjstvu, dok je nastupao u dječjim predstavama. Nakon školovanja za električara, počeo se profesionalno baviti glumom. Završio je Srednju glumačku školu u Novom Sadu, a kasnije se upisao na Kazališnu akademiju Sveučilišta u Zagrebu.

Na filmu je debitirao 1960. godine u filmu Francea Štiglica „Deveti krug“, s tematikom holokausta. Glumio je mladića koji za vrijeme rata pokušava spasiti mladu Židovku oženivši se njome. 

Do sredine 1960-ih godina Dvornik je nastupao uglavnom u komedijama, a od 1966. godine počinje se s velikim uspjehom pojavljivati i u filmovima s tematikom iz Narodnooslobodilačkog rata. 

Za uloge u filmovima Most (Hajrudin Krvavac, 1969.) i Kad čuješ zvona (Antun Vrdoljak, 1969.) nagrađen je Zlatnom arenom na festivalu u Puli. Za ulogu u ratnom filmu U gori raste zelen bor (Antun Vrdoljak, 1971.) i za ulogu vozača-zavodnika u Opkladi (Zdravko Randić, 1971.) osvojio je Srebrnu arenu. 

Nastupio je u više od 40 dugometražnih igranih filmova (nerijetko je nastupao i u kratkometražnim), u mnogim televizijskim dramama i u više televizijskih serija. 

Vrhunac popularnosti Borisa Dvornika je došao 1970-ih ulogom Roka Prča u kultnoj seriji "Naše malo misto", a potom i ulogom brijača u seriji "Velo misto". Nakon što je stekao status jednog od napriznatijih glumaca bivše Jugoslavije, Boris Dvornik uglavnom je radio u Hrvatskom narodnom kazalištu u svom rodnom Splitu.

Posljednjih godina Dvornikova karijera patila je od posljedica moždanog udara i njegovog alkoholizma, koji se manifestirao u nizu incidenata, od kojih je najpoznatiji napad na promatračicu GONG-a na hrvatskim predsjedničkim izborima 2005.